เกี่ยวกับproject ที่เรียน.วิธีการสกัด DNA

วิธีการสกัด DNA

เมื่อวานนี้ มีโอกาสดีที่ได้เตรียม NaI Solution สำหรับสกัด DNA ด้วยความไม่รู้ ประกอบกับนักศึกษาหลายคนในที่นี้ ไม่เคยมีใครเตรียมสารตัวนี้มาก่อนเลย เริ่มเตรียมกันตั้งแต่ 5 โมงเย็น จนเกือบ 2 ทุ่มครึ่ง NaI ก็ยังไม่ละลายเลย เอาไป heat ก็แล้ว ทำอย่างไรก็ไม่ละลาย จนกระทั่งเจอ Sensei พอแกแนะนำใช้เวลาไม่ถึง 10 นาทีก็เสร็จ แน่นอนมันมี trick สำหรับคนที่ไม่รู้เรื่องอย่างเรา ก็ต้องลองผิดลองถูกไปก่อน แล้วเดี๋ยวจะเล่าให้ฟัง
ผมคิดว่าเพื่อเป็นการบันทึกไว้ ให้ได้ประโยชน์สูงสุด ผมขอแสดง protocol สำหรับการสกัด DNA ด้วยวิธีนี้ไว้ด้วยจะดีกว่า
1. whole blood (sample) 0.5 ml
2. Lysis solution 0.5 ml
3. centrifuge 10,000 g for 3 min
4. ค่อยๆ เท solution ทิ้ง แล้วคว่ำปากหลอดกับกระดาษทิชชู จะสังเกตเห็นตะกอนสีขาวอยู่ก้นหลอด
5. เติม 1 ml Lysis buffer ผสมให้เข้ากัน แล้วนำไปปั่นที่ 10,000 g เป็นเวลา 3 นาที ทำขั้นตอนที่ 4 และ 5 ซ้ำ 2 ครั้ง
6. เติม Enzyme reaction solution 0.2 ml
7. เติม 20 ug/ml RNase A (อาจจะเติมหรือไม่ก็ได้ ขึ้นกับว่าต้องการทำลาย RNA หรือไม่)
8. incubate ใน heating block อุณหภูมิ 50 C เป็นเวลา 10 นาที (ขั้นตอนนี้ใน paper ใช้ที่ 37 C)
9. เติม Proteinase solution 10 ul
10. incubate ใน heating block อุณหภูมิ 50 C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง (ในpaper ใช้ที่ 37 C)
11. เติม NaI Solution 0.3 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา ขั้นตอนนี้จะเห็นตะกอนสีขาวอยู่ระหว่างชั้นของ reagent เมื่อผสมให้เข้ากันแล้ว จะเป็น ตะกอนขุ่นทั้งหลอด
12. เติม 2-isopropanol 0.5 ml ตะกอนที่ขุ่นจะกลับใส
13. centrifuge 10,000 g for 10 min
14. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4
15. เติม 40% isopropanol 1 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา
16. ปั่นที่ 10,000 g 5 นาที
17. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4
18. เติม 70% EtOH 1 ml ค่อยๆผสมให้เข้ากัน โดยการปิดฝา แล้วคว่ำ tube ไปมา
19. ปั่นที่ 10,000 g 5 นาที
20. เทน้ำใสออก เหมือนขั้นตอนที่ 4
21. นำไป vacuum dry ประมาณ 10 นาที ถ้า alcohol ยังระเหยไม่หมด ให้เพิ่มเวลา หรือนำไปอบที่ 65 C แล้วเปิดดูทุกๆ 5 นาที จนกว่า alcohol จะระเหยหมด
22. resuspend ใน TE buffer 0.1-0.5 ml (ขึ้นกับปริมาณ DNA ที่ได้) ไม่ต้องผสม ให้ตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง ข้ามคืน (ที่นี่อุณหภูมิราว 25 C)
การตรวจสอบว่ามี DNA หรือไม่ให้ run Electrophoresis ด้วย 0.5% agarose gel set voltage 100 V for 15 นาที นำไปย้อมใน Ethidium bromide 10 นาที แล้วนำไปถ่ายรูป
น้ำยาที่ใช้
Lysis buffer
1%(w/v) Triton X-100
0.32 M Sucrose
5 mM MgCl2
10 mM Tris-HCl pH 7.5
Enzyme reaction solution
1% (w/v) SDS
5% mM EDTA-Na2
10 mM Tris-HCl pH 8.0
RNase A (can be obmitted)
20 ug/ml RNase A
Proteinase solution
17 mg/ml proteinase K
NaI solution
7.6 M NaI
20 mM EDTA-Na2
40 mM Tris-HCl pH 8.0
ทีนี้กลับมาสู่ขั้นตอนการเตรียม NaI ที่ถูกต้อง ที่นี่เตรียมคราวละ 50 ml
ผสม EDTA กับ Tris-HCl ให้เข้ากันก่อน เติมน้ำ DI เพิ่มประมาณ 15-20 ml (เตรียมใน beaker) ใช้ช้อนตักสาร NaI ค่อยๆ เติมลงใน solution จนกว่าจะหมด สังเกตได้ว่ายังเป็นตะกอนละลายไม่หมด ให้ถ่าย solution ที่เตรียมนี้ลงในกระบวกตวง ปรับปริมาตรด้วยน้ำ DI จนได้ปริมาตร ประมาณ 44 ml ทีนี้ก็ตั้งใจคนให้ละลาย แป๊บเดียวก็เสร็จ เก็บที่ 4 C ในขวดสีชา
เห็นไหม ง่ายจะตาย แต่กว่าจะรู้ งมโข่งไปตั้งนาน 3ชั่วโมงครึ่งกับการลองผิดลองถูก ถามว่าคุ้มมั้ย คิดว่าคุ้มนะ เพราะมันทำให้เราจำไปจนตาย
หน้าที่ของสารแต่ละตัว
Lysis solution (contain 1% TritonX-100) ทำหน้าที่ break cell membrane
Enzyme reaction solution (contain 1% SDS) ทำหน้าที่ break nuclear membrane
RNase A ทำหน้าที่ย่อย RNA ปริมาณที่ใส่บางครั้งอาจย่อยไม่หมด เมื่อ run electrophoresis จะเห็น band ของ RNA วิ่งอยู่ตอนปลายของ gel
Proteinase solution ทำหน้าที่ย่อย protein
NaI solution ทำหน้าที่แยก protien น้ำตาล หรืออะไรก็ตามที่เกาะกับ DNA ให้หลุดออกมา เหมือนหน้าที่ของ Phenol Chloroform
Isopropanol ทำหน้าที่ตกตะกอน DNA
40% isopropanol ทำหน้าที่ล้าง DNA
70% Ethanol ทำหน้าที่ล้าง DNA แต่ด้วยเปอร์เซนต์ที่สูงขึ้น จึงทำให้แห้งได้ง่ายขึ้น ในขั้นตอนนี้หาก ไม่แห้ง ยังมี ethanol เหลืออยู่ เมื่อละลาย DNA ด้วย TE buffer แล้ว ethanol อาจ inhibit ปฎิกิริยาของ enzyme เช่นในกรณีที่ทำ PCR เป็นต้น ขึ้นกับปริมาณของ ethanol ที่ตกค้างอยู่ ทางที่ดี คือกำจัดออกไปให้มากที่สุด
ซ้ำอีกที ทั้งหมดนี้ มาจาก Reference
Lu Wang, Kazunari Hirayasu, Masaki Ishizawa and Yoshiteru Kobayashi. Perification of genomic DNA from human whole bolld by isopropanol-fractionation with concentrated NaI and SDS. Nucleic Acids Research 1994; 22(9):1774-1775

ที่มา http://gotoknow.org/blog/karn/12084